Что такое ips клетки

Обновлено: 04.07.2024

В настоящее время существует три пути перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки [2] Это:

Пересадка ядер, взятых из соматических клеток, в оплодотворенную яйцеклетку, из которой предварительно удалено ядро [3] или, в случае яйцеклетки человека, когда удаление ядра нарушает дальнейшее деление ооцита, просто в оплодотворенную яйцеклетку с ядром [4][5] ;
Слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками [6] и
Модификация соматической клетки, индуцирующая её превращение в стволовую клетку, с помощью: генетического материала кодирующего белковые репрограммирующие факторы [7][8][9] ; рекомбинантных белков [10][11] ; микроРНК [12][13][14][15] и низкомолекулярных биологически активных веществ [16] , [17][18][19][20] .

Содержание

Природные процессы индукции

Метаплазией называют обратимую замену одного дифференцированного типа клеток на другой тип зрелых дифференцированных клеток [21] . Этот переход от одного типа клеток к другому может быть частью нормального процесса созревания или вызван каким-то индуцирующим его стимулом. Примерами этого перехода можно назвать трансформацию клеток радужной оболочки глаза в линзу в процессе созревания и превращение клеток пигментного эпителия сетчатки в нейральную сетчатку при регенерации глаза у взрослых тритонов. Этот процесс позволяет организму заменить исходные клетки, не подходящие к новым условиям, на новые которые больше подходят к новым условиям. В опытах на клетках имагинальных дисков дрозофилы было обнаружено, что существует ограниченное число стандартных дискретных состояний дифференцировки и клеткам приходится выбирать одно из них. Тот факт, что трансдетерминация (смена пути дифференцировки) часто происходит не в одной, а сразу в группе клеток доказывает, что она вызвана не мутацией, а именно индуцирована [22] [23] .

Индуцированные тотипотентные клетки

Подобные технологии могут также найти клиническое применения для преодоления цитоплазматических дефектов в ооцитах человека [30] . Например, разработаны технологии, которые могут воспрепятствовать нежелательному наследованию митохондриального заболевания, которое передается следующему поколению. Митохондрии, которые часто называют «электростанцией клетки», содержат генетический материал, который передается от матери к ребёнку. Мутации митохондриальной ДНК могут вызвать диабет, глухоту, заболевания глаз, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, деменцию и ряд других неврологических заболеваний. Пересадкой ядра из яйцеклетки одного человека (несущей дефектную митохондриальную ДНК) в другую (здоровую) можно эффективно заменить цитоплазму клетки и вместе с ней митохондрии (и их ДНК) [31] . Полученная таким образом яйцеклетка может рассматриваться как имеющая двух матерей. Эмбрион образующийся после оплодотворения такой яйцеклетки будет иметь здоровую митохондриальную ДНК [32] . Однако насколько оправданы подобные манипуляции с клетками человека с точки зрения биоэтики пока не ясно.

ИПСК как результат радикального омоложения

Индуцированные прогениторные стволовые клетки

Методы прямой трансдифференцировки

Перепрограммирование путем поэтапного моделирования процессов регенерации

Ещё один способ перепрограммирования заключается в поэтапном моделировании на скелетной мышце млекопитающих процессов, которые происходят у амфибий при регенерации конечности. Таким образом, с помощью химических веществ: миосеверина (myoseverin), реверсина ((2-(4-морфолиноанилино)-6-циклогексиламинопурина) и некоторых других веществ, в условиях культуры мышечных клеток млекопитающих, которые, как известно, не способны регенерировать конечности, удалось индуцировать процессы аналогичные тем которые протекают при регенерации конечностей у амфибий и получить предшественники мышечных, костных, жировых и нервных клеток [72] [73] .

Условно перепрограммированные клетки (УПК)

Ричард Шлегель и его исследовательская группа разработали метод [74] , который позволяет размножать in vitro культуру клеток похожих на взрослые стволовые клетки, без каких-либо генетических манипуляций. Они показали, что под воздействием облученных фибробластов (см. обзоры [75] и [76] ) и ингибитора Rho киназы - Y-27632 [77] , первичные эпителиальные клетки млекопитающих переходят к состоянию неограниченной пролиферации (что, по мнению авторов, связано с ростом концентрации β-катенина в ядре и снижением Notch сигнализации). Индукция УПК происходит довольно быстро (в течение 2 дней) и является результатом «перепрограммирования» всей клеточной популяции, а не одной из ее субпопуляций. При этом в УПК не наблюдалась характерная для ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) активация синтеза Sox2, Oct4, Nanog, и Klf4. Эта индукция УПК обратима - достаточно удалить Y-27632 и облученные фибробласты, чтобы клетки перешли к обычной дифференцировке [78] [79] [80] . Этот метод может иметь большое будущее в регенеративной медицине, так как эти клетки в отличие от ИПСК не образуют опухоли [81] [82] . Так, например, используя технологию условно-перепрограммированных клеток, исследователи смогли найти эффективную терапию для пациента с редким типом опухоли легких [83] .

Косвенное перепрограммирование клеток (ILC)

Разработан метод при котором соматические клетки переходят в промежуточное пластическое состояние- частично перепрограммированные ИПСК (pre-iPSC), индуцированное кратковременным воздействием перепрограммирующих факторов, а затем дифференцируются с помощью специально разработанной химической среды (искусственной ниши). [84] Предполагается, что этот новый метод может быть более эффективным и безопасным, так как он, по мнению его авторов, не вызывает опухоли или другие нежелательные генетические изменения, и при этом позволяет получать требуемые клетки быстрее и c гораздо большим выходом по сравнению с другими методами. Тем не менее, безопасность этих клеток все же сомнительна - учитывая то, что преобразование из пре-ИПСК опирается на использование условий перепрограммирования в ИПСК, и нельзя исключить что часть клеток может все же приобрести плюрипотентные свойства(если они не прекратят процесса де-дифференциации in vitro или в связи с дальнейшей де-дифференцировкой in vivo).

Индуцированные нервные стволовые клетки (иНСК)

Индуцированные кардиомиоциты (иКМ)

Биоинженерия клеток кровеносных сосудов

Кровеносные сосуды образуют обширные сети, которые в течение всей жизни обеспечивают клетки организма питательными веществами и кислородом. Когда кровеносные сосуды становятся старше, их структура и функции, нередко, отклоняются от нормы, способствуя тем самым многочисленным возрастным заболеваниям, таким как: инфаркт миокарда, ишемический инсульт и атеросклероз артерий, питающих сердце, мозг и нижние конечности. Поэтому, важной задачей является стимулирование роста сосудов для обеспечения циркуляции, чтобы предотвратить обострение этих заболеваний. Одим из способов стимулирования роста сосудов является имплантация индуцированных прогениторных клеток эндотелия (иПЭк). [84] Так, например, с помощью иПЭк, полученных путем частичного перепрограммирования клеток эндотелия, удалось добиться увеличения коронарного кровотока и по данным эхокардиографии улучшить функционирование сердца [93] . Стволовые клетки, извлеченные из жировой ткани после липосакции можно превратить в прогениторные гладкие мышечные клетки (иПГМк), участвующие в формировании артерий и вен. Это клетки могут быть использованы для создания кровеносных сосудов, необходимых для замены неисправных артерий сердца [94] .

Биоинженерия стволовых клеток крови

Эритроциты

Переливание эритроцитов необходимо для многих пациентов с травмами или гематологическими заболеваниями. Однако, на сегодняшний день, поставка эритроцитов зависит от добровольных доноров число которых недостаточно. Кроме того, переливание крови от доноров сопряжено с определенным риском из-за возможности передачи ряда инфекций. Решить эту проблему могло бы производство необходимых количеств эритроцитов вне организма [95] . В принципе уже доказано, что эритроциты, полученные вне организма из мобилизованных CD34-позитивных клеток, способны выжить при переливании аутологичному реципиенту [96] . К сожалению, эритроциты, получаемые in vitro, как правило, содержат исключительно зародышевый гемоглобин (HbF), который непригоден для нормального функционирования эритроцитов во взрослом организме. Тем не менее, in vivo, после трансфузии полученных из ИПСК эритроидных прогениторных клеток содержащих ядро, наблюдалось переключение на синтез взрослой изоформы гемоглобина [97] . Однако в этом случае возникает другая проблема: несмотря на то, что эритроциты не имеют ядер, и, следовательно, не могут образовывать опухоли, их непосредственные предшественники эритроидные прогениторные клетки ядром обладают и следовательно потенциально опасны. Созревание эритробластов в функционально зрелые эритроциты требует сложного процесса реорганизации, который заканчивается удалением ядра с образованием безъядерных эритроцитов [98] . Увы, методы перепрограммирования клеток в настоящее время часто приводят к нарушению этих процессов энуклеации и поэтому использование эритроцитов или их непосредственных предшественников эритробластов для переливания ещё недостаточно защищено от возможности образования опухолей. Тем не менее Bouhassira и его коллеги обнаружили, что кратковременное воздействие цитокинов, благоприятствующих дифференциации стволовых клеток в эритроидные, на CD34 позитивные клетки, до их размножения с последующей пролиферацией полученных предшественников, позволяет получать на порядок больший выход эритроидных клеток, чем наблюдалось ранее. И что самое главное: эти красные кровяные клетки имели те же изоформы глобина что и использованные в качестве источника CD34 позитивные клетки [99]

См. также: Migliaccio AR, Whitsett C, Papayannopoulou T, Sadelain M. (2012) The potential of stem cells as an in vitro source of red blood cells for transfusion. Review. Cell Stem Cell.;10(2):115-9

Тромбоциты

Индуцированные стволовые/стромальные клетки мезенхимы (ИМСК)

Источники соматических клеток

Наиболее часто для перепрограммирования используют получаемые биопсией фибробласты кожи и клетки крови [108] [109] [110] [111] , однако удобнее получать соматические клетки из мочи [112] [113] [114] . Этот способ не требует биопсии или взятия образцов крови и поэтому безвреден для пациента. Важно отметить, что происхождение соматических клеток используемых для перепрограммирования может оказывать влияние на эффективность перепрограммирования [115] [116] , функциональные свойства получаемых индуцированных стволовых клеток [117] и способность к образованию опухолей [118] .

Способы доставки репрограммирующих факторов в ядро

Способы доставки можно подразделить на вирусные и невирусные, а также на те, что связаны с интеграцией векторов несущих репрограммирующие факторы в геном и действующие без интеграции.

Доставка вирусами

Чаще всего для доставки используются вирусные векторные системы. Вирусы используют свой врожденный механизм заражения клетки, что позволяет использовать их для доставки и внедрения кассеты генов необходимых для экспрессии репрограммирующих факторов В качестве вирусов для доставки генов обычно используют:

. Они в качестве генома содержат одноцепочечную молекулу РНК. С помощью обратной транскрипции на РНК вируса синтезируется линейная двухцепочечная ДНК которая затем интегрируется в двухцепочечную ДНК генома клетки-хозяина. Описан метод эффективного перепрограммирования клеток человека в ИПСК с помощью одного вектора содержащего четыре ТФ, в сочетании с коктейлем, содержащим три небольшие молекулы. [119] Приведены прописи аналогичных методов. [120]

. Они являются подклассом ретровирусов. В отличие от ретровирусных векторов, лентивирусные векторы могут заражать не только делящиеся клетки, но и находящиеся в покое терминально дифференцированные клетки. [121][122][123]

Вирус Сендай - вирус из семейства Paramyxoviridae, содержащий одноцепочечную РНК [124]

Не интегрирующиеся аденовирусы [125]

Невирусная доставка векторов

По сравнению с вирусными векторами, не-вирусные векторы являются потенциально менее иммуногенными и их сравнительно легче использовать в условиях клиники.

Невирусным подходом является прямая доставка в клетку синтетической мРНК кодирующей четыре канонических фактора Яманаки: KLF4, c-MYC, OCT4, и SOX2. Метод позволяет достичь высокой эффективности перепрограммирования, но технически сложен и сильно зависит от качества реактивов [126]

Перепрограммирование мышечных клеток головастиков Xenopus в недифференцированные клетки может быть достигнуто In vivo с помощью ДНК мыши кодирующей Oct4, Sox2, и Klf4 в условиях способствующих регенерации. [127]

Привлекательным методом невирусной доставки генов, который позволяет эффективно встраивать желаемую ДНК в геном различных клеток является использование транспозонов – сложных структур содержащих дискретные куски ДНК, обладающие способностью изменять свое местоположение в геноме посредством механизма транспозиции (инсерции), вынуждающего его включиться или наоборот покинуть определенный участок генома. Транспозон состоит из инсерционных сегментов ДНК, которые могут перемещаться как единое целое, захватывая лежащие между ними гены. Описано несколько транспозонных систем пригодных для транспортировки генов в клетки млекопитающих. Это «Спящая красавица» - Sleeping Beauty (SB), SB100X, и Tol2 и PiggyBac (PB). Разработаны эффективные методики получения ИПСК мыши и человека введением в соматические клетки векторов на основе PiggyBac (PB) [128] В том числе с кассетой из ДНК кодирующей 6 факторов (Oct4, c-Myc, Klf4, Sox2 плюс Rarg (retinoic acid receptor gamma - RAR-γ) и Lrh-1 (liver receptor homologue 1 известный также как Nr5a2). [129] , что позволило сократить продолжительность перепрограммирования до 4-12 дней и поднять его эффективность до уровня сопоставимого с методами переноса ядер и слияния клеток.

Перспективы изучения индуцированных стволовых клеток для медицины

Ярким свидетельством важности индуцированных стволовых клеток для медицины будущего, а значит и для всего человечества, стало присуждение Джону Гордону и Шинья Яманаке Нобелевской премии 2012 года по медицине. Надо отметить, что большую часть от выигранного приза в £750,000 Шинья Яманака решил потратить на развитие своих исследований.

Обзор

Автор

Редактор

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Открытие индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) стало одним из самых громких и многообещающих достижений в научном мире за последние годы. Казалось бы, как только у каждого человека появятся свои собственные плюрипотентные стволовые клетки, разрешится огромное количество медицинских проблем. Тем не менее прошло уже почти десять лет, а применение ИПСК в реальной практической медицине толком еще и не начиналось. По-прежнему между открытием ИПСК и спасением мира от всех недугов стоит основная проблема — методы индукции плюрипотентности в клетках. Способом преодолеть эту пропасть может быть поиск клеточных типов, легче поддающихся перепрограммированию. Один из этих типов лежит буквально «на поверхности» — клетки дермальной папиллы.

Обратите внимание!

Эта статья опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2015.

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Стволовые клетки — панацея XXI века

* — Стволовые клетки можно получать и другими способами: ими может безо всякого ущерба для развития поделиться эмбрион («Щадящие стволовые клетки» [2]) или. его обиталище («Эндометрий как альтернативный источник стволовых клеток» [3]). — Ред.

** — О ситуации в области создания искусственных органов и технологиях их получения рассказывает статья «Органы из лаборатории» [4]. — Ред.

Помимо этого, впервые открываются возможности лечения генетических заболеваний. Молекулярная биология также не стоит на месте: разрабатывается огромное количество методов, позволяющих редактировать геном*, исправлять в нём «ошибки» или вносить дополнительные элементы. Но все эти методы малоэффективны применительно ко взрослому организму — дифференцировка его клеток, формирование органов и тканей происходили под влиянием причинных мутации. Чем же могут помочь ИПСК? Эти клетки представляют собой начальную форму клеточного развития. При коррекции генома на данной стадии последующая дифференцировка пройдет без отклонений.

* — Сейчас при разработке генотерапевтических подходов особые надежды возлагают на системы редактирования ZFN, TALEN и CRISPR/Cas9, основанные на сайт-специфическом действии нуклеаз in vivo. Эти системы обычно состоят из двух модулей, один из которых распознает нужную олигонуклеотидную последовательность, а другой режет цепи ДНК: «А не замахнуться ли нам на. изменение генома?» [5], «CRISPR-системы: иммунизация прокариот» [6]. И некоторые из подходов уже вполне «осязаемы», раз громче звучат голоса биоэтиков: «Мутагенная цепная реакция: редактирование геномов на грани фантастики» [7]. — Ред.

Какие могут быть проблемы?

Несмотря на активное изучение ИПСК, существует ряд проблем, затрудняющих их использование непосредственно для лечения человека. Эти проблемы связаны со способом индукции плюрипотентности («перепрограммированием») клеток. Надо сказать, еще совсем недавно даже мысль о существовании таких способов относилась к категории еретических, ведь дифференцировка считалась процессом необратимым — до «нобелевских» работ Джона Гёрдона и Синьи Яманаки [8]. Как установила группа Яманаки, для перепрограммирования терминально дифференцированных клеток необходимо всего четыре транскрипционных фактора: Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4 [9]. Транскрипционные факторы (ТФ) — это белки, способные регулировать работу генов. При работе этих четырех ТФ геном клетки перестраивается в плюрипотентное состояние. На данный момент единственным эффективным способом получения ИПСК является внесение генов ТФ в клетку с помощью лентивирусных векторных конструкций. Такой метод приводит к интеграции вектора в геном клетки, что может вызвать непредвиденные модификации его структуры и привести к развитию злокачественных образований. Кроме этого, сами вирусные конструкции являются антигенами для человека, что также небезопасно и ограничивает возможности практического применения ИПСК [10].

Тем не менее.

Тем не менее некоторые ИПСК всё же добрались до применения на практике. Например, с их помощью начали лечить серповидноклеточную анемию*. ИПСК получали из клеток пациента и с помощью специализированных генетических методов исправляли мутацию, приводящую к этому заболеванию [11]. В конечном итоге ИПСК дифференцировали в здоровые эритроциты и вводили пациенту. Дело в том, что эритроциты — это тот редкий случай, когда непредсказуемая интеграция генов ТФ в клеточный геном не представляет никакой опасности, потому что в процессе дифференцировки эритроциты теряют ядро.

* — Генные и клеточные инженеры вообще неравнодушны к заболеваниям крови, и старания их приносят всё более ощутимые результаты — как по эффективности, так и по безопасности: «Сводка с генотерапевтических фронтов. Новая стратегия нейтрализации гемофилии» [12]. — Ред.

Что же делать?

Решать вышеперечисленные проблемы можно с помощью двух независимых стратегий. Первая стратегия заключается в поиске альтернативных безопасных способов введения транскрипционных факторов*. На сегодняшний день в этом направлении ведется множество работ. Например, в качестве поставщика генов ТФ используют аденовирусные конструкции, не встраивающиеся в клеточный геном. При другом подходе ТФ доставляют в клетку не в виде генов, а в виде РНК-матриц или готовых белков. Даже в рамках интегративных методов доставки транскрипционных факторов ведутся работы по снижению рисков их использования за счет встраивания всех четырех генов в одну рамку считывания. Вариантов доставки факторов транскрипции в клетку очень много, но все они проигрывают привычным лентивирусным конструкциям по двум параметрам — по эффективности и оптимальности материальных затрат и сил. Последнее тоже немаловажно, так как в перспективе перепрограммирование клеток будут производить не в лабораторных, а в медицинских масштабах.

* — Редкий человек не слышал о дурном поведении чужих и даже собственных по каким-то причинам слабо контролируемых стволовых клеток: «Ствол и ветки, стволовые клетки» [1]. Методология получения ИПСК ещё больше повышает градус онкологической настороженности: проблему представляет встраивание в геном не только векторной ДНК с активными промоторами, но и протоонкогенов — да, гены двух из четырех «магических» ТФ (c-Myc и Klf4) относятся к протоонкогенам. Поэтому стараются всеми способами найти баланс между эффективностью перепрограммирования и безопасностью, меняя спектр ТФ или вовсе исключая введение генно-инженерных конструкций — есть надежда, что в перспективе будет достаточно просто «похимичить»: «Снежный ком проблем с плюрипотентностью» [10], «Была клетка простая, стала стволовая» [9]. — Ред.

Вторая стратегия заключается в поиске оптимального типа клеток для перепрограммирования. Оказалось, что разные типы клеток могут значительно различаться по своей способности давать линии ИПСК. Эти различия проявляются в неодинаковых скорости и эффективности (из одного и того же количества клеток разных типов получается разное количество клонов ИПСК) перепрограммирования. Способность клеточного типа к перепрограммированию зависит от разных факторов. Некоторые клетки являются мультипотентными или просто активно обновляющимися, что ставит их ближе, чем терминально дифференцированные клетки, к плюрипотентному состоянию.

Кроме эффективности такого превращения, клетки отличаются числом транскрипционных факторов, необходимых для их перепрограммирования. Клетки, «откликающиеся» на меньшее число факторов транскрипции, не только значительно сокращают риски даже опасных способов введения ТФ, но и увеличивают эффективность уже найденных безопасных. К таким клеткам относятся, к примеру, нейроны, способные перепрограммироваться при введении не четырех, а всего лишь одного транскрипционного фактора [13]. Но нейроны не подходят для повсеместного создания ИПСК в медицине из-за сложности их выделения из организма. Помимо простоты получения оптимальный тип клеток должен быть в наименьшей степени подвержен агрессивному воздействию внешней среды, а значит, к таким клеткам нельзя отнести кожные фибробласты, наиболее часто используемые для перепрограммирования [14].

Клетки дермальной папиллы — возможный ключ к решению проблем

Рисунок 1. Строение волосяного фолликула. Дермальная папилла, или волосяной сосочек, находится в основании волосяной луковицы.

В 2011 году было показано, что клетки дермальной папиллы мыши также можно перепрограммировать с помощью всего лишь одного ТФ — Oct4 [15]. С тех пор идея перепрограммирования клеток дермальной папиллы больше не выдвигалась, что кажется весьма странным, поскольку эти клетки как нельзя лучше подходят на роль источника ИПСК. Дермальная папилла (ДП) — это соединительнотканный сосочек в волосяной луковице (рис. 1); он находится в глубоких слоях кожи и в меньшей мере подвержен агрессивным воздействиям окружающей среды. Кроме этого, клетки ДП удобны для выделения: для получения культуры клеток достаточно нескольких выдернутых волос. Но что самое главное, эти клетки легко поддаются перепрограммированию и требуют меньше вмешательств в транскриптом, что значительно безопаснее по сравнению с классическим перепрограммированием четырьмя транскрипционными факторами. К сожалению, работа проводилась на мышиных клетках [15], а на человеческих ее результаты проверены не были.

Рисунок 2. Результат от-ПЦР-анализа клеток дермальной папиллы человека, терминально дифференцированных фибробластов и ИПСК на экспрессию факторов Яманаки. Можно видеть, что в клетках дермальной папиллы присутствуют три из четырех транскрипционных факторов. Рисунок из диплома автора статьи [16].

Как следствие, в 2014 году в лаборатории генетики развития Института общей генетики им. Н. И. Вавилова в рамках одной из дипломных работ была поставлена следующая задача: определить минимальный набор транскрипционных факторов, необходимых для перепрограммирования клеток дермальной папиллы. Для начала было проведено более детальное изучение экспрессии генов транскрипционных факторов в клетках дермальной папиллы человека. Оказалось, что в этом типе клеток в обычном состоянии экспрессируются гены трех из четырех ТФ Яманаки: SOX2, KLF4 и c-MYC (рис. 2). Факт экспрессии KLF4 и c-MYC не удивляет, так как их продукты участвуют в процессах пролиферации и регуляции клеточного цикла и присутствуют в дифференцированных клетках — например, в кожных фибробластах. Но Sox2 является фактором плюрипотентности и встречается в уже перепрограммированных ИПСК, где есть все ТФ; в этом клетки дермальной папиллы уникальны. Таким образом, если в этих клетках уже синтезируются три из четырех транскрипционных факторов, действительно есть основания полагать, что перепрограммирование клеток ДП человека с помощью одного лишь фактора Oct4 осуществимо.

При дальнейших исследованиях выяснилось, что клетки ДП человека хуже поддаются перепрограммированию, чем аналогичные клетки мыши — оно идет значительно дольше и с меньшей эффективностью. Это вполне логично, так как волосяной покров человека в процессе эволюции изменил свои физиологические функции по сравнению с покровом остальных млекопитающих. На данный момент удалось провести перепрограммирование только с помощью двух ТФ — Oct4 и Sox2 (рис. 3), — что уже является неплохим результатом, так как сокращает вдвое вышеописанные риски повреждения генома при использовании вирусных конструкций [16].

Встает закономерный вопрос: почему для перепрограммирования потребовалось более одного транскрипционного фактора, если в клетках и так присутствуют три из них? Видимо, естественной экспрессии генов ТФ в клетках дермальной папиллы оказалось недостаточно для перестройки генома в плюрипотентное состояние, и для перепрограммирования одним фактором транскрипции понадобятся вспомогательные низкомолекулярные агенты, облегчающие его работу. По некоторым данным, малые органические молекулы даже без прямого влияния на активность генов способны «катализировать» переведение клеток в плюрипотентное состояние, заменяя при этом часть ТФ [9].

Рисунок 3. ИПСК, полученные из клеток дермальной папиллы человека. А — Характерная морфология плюрипотентных стволовых клеток: плотные колонии из мелких клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Б — Окраска ИПСК на маркеры плюрипотентности Oct4, Nanog, Tra 1-60 и SSEA4, наличие которых доказывает завершение перепрограммирования. Рисунок из диплома автора статьи [16].

Конечно, за один год дипломной работы пропасть между теорией и практикой автором этой статьи преодолена не была, однако дальнейшие пути исследований вырисовываются четче. Приведенные выше результаты показали, что клетки дермальной папиллы действительно находятся ближе к плюрипотентности, чем обычные терминально дифференцированные клетки, и исследования перепрограммирования клеток ДП человека одним транскрипционным фактором нужно продолжать. Вероятно, в ближайшее время в других лабораториях, где занимаются альтернативными безопасными способами введения факторов транскрипции, тоже найдется оптимальное решение, и, сложив два и два, мы таки придем к медицине будущего.

Текст научной работы на тему «Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и современные методы их получения»

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ПРИКЛАДНОЙ БИОЛОГИИ И БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Н. С. Волкова, А. С. Ермаков

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и современные методы их получения

Стволовые клетки и их типы

Стволовые клетки - клоногенные клетки, способные к самообновлению и дающие начало различным специализированным клеткам организма (Weissman, 2000). Имеют следующие отличительные характеристики: 1. Клоногенность (происхождение популяции клеток из одной). 2. Самообновление (способность к самовоспроизведению в недифференцированном состоянии). 3. Высокая потентность (способность клеток к дифференцировке в различные типы клеток) (Kolios, Moodley, 2013).

Тотипотентная клетка обладает самой высокой потентностью и способна сформировать организм, а также внезародышевые оболочки (Kolios, Moodley, 2013). Плюрипотентные клетки обладают меньшей потентностью, они способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и эндодермы) и дают начало всем клеткам организма, включая половые клетки (Kolios, Moodley, 2013). Мультипотентные и олигопотентные клетки обладают меньшим потенциалом и способны дать начало клеткам в пределах одного зародышевого листка. (Ratajczak et al., 2012, Augello et al, 2010). Унипотентные клетки - предшественники клеток одного типа, имеют ограниченное число делений, это незрелые тканеспецифичные клетки (Kolios, Moodley, 2013, Dulak et al., 2015).

Стволовые клетки в зависимости от происхождения можно разделить на эмбриональные, взрослые и индуцированные.

Эмбриональные стволовые клетки - плюрипотентные стволовые клетки, выделенные из внутренней клеточной массы бластоцисты. В 1981 г. две группы исследователей впервые получили эмбриональные стволовые клетки мыши путем высаживания бластоцист на слой фидерных клеток (Martin, 1981, Evans, Kaufman, 1981). В 1998 г. группа исследователей во главе с Д. Томсоном впервые разработала метод выделения и культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток (Thomson et al., 1998), используя человеческие бластоцисты. Клетки обладали плюрипотентностью, при подсадке таких клеток имму-нодефицитным мышам образовывались тератомы, содержащие производные всех трех зародышевых листков (Thomson et al., 1998).

Взрослые стволовые клетки мульти-, олиго- или унипотентны, т. е. имеют довольно ограниченный дифференцировочный потенциал. Тка-неспецифичные стволовые клетки, необходимые для регенерации, возникают в течение онтогенеза и остаются в спокойном состоянии, пока местные раздражители не активируют их пролиферацию, дифференциацию или миграцию (Уоод е! а1., 2010).

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) -это репрограммированные дифференцированные клетки, которые приобретают характеристики эмбриональных стволовых клеток. В 2006 К. Такахаши и С. Яманака впервые получили индуцированные (репрограммированные) плюрипотентные клетки мыши (ТакаИаэМ, Уатапака, 2006), используя четыре репрограммирующих фактора: Ос!4, К^4, Бох2 и с-Мус, доставленных в ядро с помощью ретровирусных конструкций. В 2007 г. ими были получены индуцированные стволовые клетки человека (ТакаИаэЫ е! а1., 2007). Эти клетки были практически идентичны эмбриональным стволовым клеткам в плане морфологии, экспрессии генов, те-ломеразной активности, имели те же поверхностные антигены и были плюрипотентными (ТакаИаэЫ е! а1., 2007).

Перспективы практического применения иПСК

Как эмбриональные или взрослые стволовые клетки, так и иПСК могут быть использованы для моделирования болезней, скрининга лекарств, проверки токсичности препаратов. Важным применением является возможное использование этих клеток непосредственно в терапевтических целях для лечения пациентов с помощью клеточной терапии. Взрослые стволовые клетки, полученные от конкретного пациента, могли бы быть оптимальным типом клеток, поскольку в данном случае отсутствует риск иммунного отторжения, однако они имеют ограниченный дифференцировочный потенциал и, кроме того, их трудно выделить и быстро нарастить в достаточном для терапевтического использования количестве.

Эмбриональные стволовые клетки очень привлекательны для медицинского применения, они плюрипотентны и их можно нарастить практически в неограниченном количестве. Однако, для их получения необходимо разрушить человеческий эмбрион, что создает этические проблемы. Кроме того, в данном случае возможен риск иммунного отторжения (Тгоипэоп, 2006).

Важным преимуществом иПСК перед ЭСК является то, что они могут быть получены из клеток взрослого организма, а не из эмбриона, что, во-первых, решает этическую проблему, а во-вторых, позволит получать «родные» клетки без риска отторжения.

Но существуют и проблемы, связанные с возможным применением иПСК, и основная из них - потенциальная онкогенность иПСК, так как основные пути, обеспечивающие плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток, частично совпадают с процессами при онкогенезе.

Еще одной важной проблемой было использование вирусов в качестве генетических векторов. иПСК, полученные с помощью генетических векторов, могут иметь непредсказуемые генетические дисфункции. Разработанный С. Яманака и его коллегами метод оказался неприемлимым для использования в практической медицине. Поэтому за прошедшие десять лет усилия исследователей были направлены на поиски альтернативных методов получения иПСК, более подходящих для практической медицины.

Основные методы получения индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток

Ретровирусные конструкции. К. Такахаши и C. Яманака, пионеры в области получения иПСК, определили четыре репрограммирующих фактора: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc. Эти репрограммирующие факторы были доставлены ретровирусным вектором. Недостатками использования ре-тровирусного вектора являются потенциальная генетическая нестабильность клеток и его низкая внедряемость в неделящиеся клетки, т. е. невозможность его использования для репрограммирования неделя-щихся или медленно делящихся клеток (например, нейронов) (Takahashi, Yamanaka, 2006, Takahashi et al., 2007).

Лентивирусные конструкции. Также для доставки генного материала используются летивирусы, их особенностью является способность заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, что позволяет их использовать при перепрограммировании всех видов соматических клеток (Yu et al., 2007). Кроме того, они обладают большей вместимостью и менее подвержены иммунному ответу.

Общим недостатком использования вирусных векторов является сам принцип, при котором гены внедряются в геном клетки, что может повлечь появление мутаций (инсерционный мутагенез); эффективность репрограммирования сильно зависит от «эффекта положения», т. е. место, куда внедрился вирусный вектор, влияет на экспрессию закодированных в нем генов. Также снижению эффективности данного способа способствует естественный клеточный иммунитет, защищающий клетку от внедрения чужеродных генов.

Основной же проблемой использования интеграционных методов является высокий риск канцерогенеза. Существуют эпигенетические механизмы, «выключающие» гены плюрипотентности, что обеспечивает дальнейшую нормальную дифференцировку клеток. Эти же механизмы действуют и на гены, внедренные вирусными векторами. Однако, существует вероятность того, что внедренные гены, которые по сути являются онкогенами для соматических клеток и клеток, начавших процесс дифференцировки, будут продолжать экспрессироваться. В таком случае это приведет к развитию злокачественных опухолей из иПСК (Hotta, Ellis, 2008).

Для решения проблемы инсерционного мутагенеза и снижения риска канцерогенеза были разработаны неинтеграционные методы, использующие векторы на основе аденовирусов и вируса Сендай.

В 2008 г. группа ученых во главе с С. Дунканом получила ИПСК неинтеграционным методом. В качестве вектора для доставки репрограм-мирующих факторов (Ос!4, Бох2, К^4, и с-Мус) был использован аденовирус. Аденовирусы способны переносить генетический материал как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, обеспечивают достаточно высокую экспрессию и, как правило, не встраиваются в геном клетки. Риск канцерогенеза был сведен к минимуму, но эффективность данного метода оказалась намного ниже, чем эффективность при использовании интеграционных векторов (Б1а^е№ е! а1., 2008).

В 2009 г. Н. Фузаки и коллеги получили иПСК, используя вектор на основе вируса Сендай (Риэак е! а1., 2009). Вирус Сендай содержит РНК, и, следовательно, не сможет встроиться в геном клетки. При использовании вектора на основе вируса Сендай довольно трудно было убрать вектор по завершении репрограммирования. И хотя вирус спонтанно утрачивается в процессе деления клеток, необходимо применение дополнительных процедур по селекции иПСК либо модификация векторов. Основным препятствием для использования таких векторов остается низкая эффективность репрограммирования.

Плазмиды. Еще одним неинтеграционным методом является использование плазмид (небольших кольцевых молекул ДНК) для доставки репрограммирующих факторов. Использование плазмид - довольно простой, доступный метод. Применение плазмид позволяет избежать интеграции в геном, однако в первых экспериментах, проведенных К. Окита, была обнаружена интеграция плазмидного вектора в геном клетки. Оптимизация протокола позволила избежать интеграции экзогенной ДНК (ОкИа е! а1., 2008). В 2010 г. другая группа ученых также получила иПСК, используя плазмидный вектор. Проведенные анализы показали отсутствие внедренной плазмидной ДНК в геном иПСК (БМауеЬ е! а1., 2010). Недостатком использования плазмид является низкая эффективность репрограммирования.

Современные альтернативные методы

Искуственные хромосы. Обладают большой вместимостью и сохраняются при делении клетки. Экспрессия генов, внедренных с использование искусственных хромосом, гораздо более стабильна и менее зависит от эффекта положения. М. Хирацука и коллеги разработали искусственную хромосому, содержащую ДНК, в которой закодированы 4 репрограммирующих фактора: К^4, с-Мус, Бох2 и Ос!4, а также ген, «выключающий» белок р-53 (Н^эика е! а1., 2011). Белок р53 является опухолевым супрессором, он также выполняет множество других функций,

например, принимает участие в дифференцировке и регуляции клеточного цикла; в данном случае его «отключение» позволяет повысить эффективность репрограммирования. Недостатками этого метода является сохранение возможности интеграции внедренных генов в геном клетки, довольно низкая эффективность метода и возможные отрицательные последствия подавления белка р53 в процессе репрограммирования.

мРНК. Метод, разработанный Л. Варрен и коллегами, заключается в периодическом введении в культуру соматических клеток синтетической мРНК, кодирующей 5 репрограмирующих факторов (KLF4, c-MYC, OCT4, SOX2, LIN28) (Warren et al., 2010). Основной проблемой использования экзогенной мРНК является слишком быстрая ее деградация и необходимость периодического введения синтетической мРНК, что может привести к повреждению клеток.

Использование рекомбинантных репрограммирующих белков

Доставка белков в клетку может быть осуществлена как инвазивны-ми методами (микроинъекция, электропорация), так и неинвазивным методом (создание рекомбинантного белка, путем присоединения к исходному белку короткого катионного пептида, способного проникать через клеточную мембрану). Использование неинвазивного метода очень привлекательно, так как не повреждает клетки и не требует специального оборудования. Х.Чжоу и его коллеги разработали метод получения иПСК с помощью внедрения в клетки рекомбинантных белков, в которых полиаргинин (выполняющий транспортную функцию) связан с С-концевыми доменами 4 репрограммирующих факторов Oct4, Sox2, Klf4, и c-Myc (Zhou et al., 2009).

Риск инсерционного мутагенеза отсутствует, но эффективность данного метода является низкой. Сам процесс репрограммирования довольно длительный и содержит несколько циклов внедрения, также при использовании данного метода необходимо получать достаточное количество хорошо очищенного рекомбинантного белка.

Использование смесей («коктейлей») низкомолекулярных соединений для получения иПСК

В последние годы растет интерес к использованию малых молекул для репрограммирования соматических клеток и получения иПСК. Надежду на разработку таких методов дает факт существования в цитоплазме яйцеклетки факторов, приводящих к репрограмированию пересаженного ядра. Некоторые низкомолекулярные соединения повышают эффективность репрограммирования, а некоторые из них, либо их комбинации, могут функционально заменить транскрипционные факторы. Исследователями были предприняты попытки получить иПСК путем использования лишь низкомолекулярных соединений (Lin, Wu, 2015, Hou et al., 2013).

В 2013 г. группе П. Хоу и коллегам удалось получить мышиные иПСК (Hou et al., 2013), подобрав молекулы, заменяющие действие четырех транскрипционных факторов. С помощью «коктейля» из 7 низкомолекулярных соединений они получили линию иПСК из мышиных фибробластов. Основным недостатком такого подхода является сложная трехступенчатая процедура обработки клеток комбинациями из малых молекул.

Однако пока не удается подобрать «коктейль» из малых молекул для получения человеческих иПСК, вероятно, из-за большей сложности молекулярных процессов, происходящих при репрограммировании клеток у человека (Lin, Wu, 2015).

Бурное развитие фундаментальной биологии в последние десятилетия идет в тесном взаимодействии с разработкой новых медицинских технологий. Плюрипотентные стволовые клетки дают нам большие надежды на создание новых методов клеточной терапии и их внедрение в медицинскую практику. Особенно перспективны для практического применения в медицине индуцированные плюрипотентные клетки (иПСК), так как они могут быть получены индивидуально для каждого пациента и, кроме того, для их получения не нужно разрушать человеческий эмбрион.

Классический метод получения иПСК с помощью введения в клетки ретровирусных генетических конструкций потенциально может привести к генетической нестабильности клеток. В настоящее время разрабатываются альтернатиные методы получения иПСК. Наиболее перспективной, с нашей точки зрения, является разработка методов репрограммирования сомтических клеток в иПСК с помощью мРНК и подбора смесей («коктейлей») малых молекул, так как в данных случаях не нарушается геном клеток, и риск генетической нестабильности исключен.

1. Augello A, Kurth TB, De BC: Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. EurCell Mater 2010; 20: 121-133.

2. Bayart E, Cohen-Haguenauer O.Technological Overview of iPS Induction from Human Adult Somatic Cells. Curr Gene Ther. 2013; 13(2): 73-92.

3. Dulak J, Szade K, Szade A, Nowak W, Jozkowicz A. Adult stem cells: hopes and hypes of regenerative medicine. Acta Biochim Pol. 2015;62(3):329-37.

5. Hiratsuka M, Uno N, Ueda K, Kurosaki H, Imaoka N, Kazuki K, Ueno E, Akakura Y, Katoh M, Osaki M, Kazuki Y, Nakagawa M, Yamanaka S, Oshimura M. Integration-free iPS cells engineered using human artificial chromosomevectors. PLoS One. 2011;6(10):e25961.

6. Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, Li H, Zhao T, Ye J, Yang W, Liu K, Ge J, Xu J, Zhang Q, Zhao Y, Deng H. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science. 2013;341(6146):651-4.

7. Hotta A, Ellis J. Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states. J Cell Biochem. 2008;105(4):940-8.

8. Kolios G, Moodley Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 2013;85(1):3-10.

9. Lin T, Wu S.Reprogramming with Small Molecules instead of Exogenous Transcription Factors. Stem Cells Int. 2015;2015:794632.

11. Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 2008;322(5903):949-53.

12. Ratajczak MZ, Zuba-Surma E, Kucia M, Poniewierska A, Suszynska M, Ratajczak J: Pluripotent and multipotent stem cells in adult tissues. Adv Med Sci. 2012; 57: 1-17.

13. Si-Tayeb K, Noto FK, Sepac A, Sedlic F, Bosnjak ZJ, Lough JW, Duncan SA. Generation of human induced pluripotent stem cells by simple transient transfection of plasmid DNA encoding reprogramming factors. BMC Dev Biol. 2010;10:81.

14. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 2008;322(5903):945-9.

15. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007; 131: 861-872.

16. Takahashi K, Yamanaka S: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126: 663-676.

17. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282(5391):1145-7.

19. Voog J, Jones DL: Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell 2010; 6: 103-115.

21. Weissman IL Stem cells: units of development units of regeneration and units in evolution. Cell. 2000; 100: 157-168).

23. Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Schöler HR, Duan L, Ding S. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 2009;4(5):381-4.

Читайте также: